使用 CaRPool-Seq 解开基因网络
在不到十年的时间里，CRISPR-Cas 系统已成为功能基因组学筛选中不可或缺的一部分。通过不断扩展的 CRISPR 工具包，研究人员可以剖析复杂的基因-表型关系并更深入地研究疾病过程，从而有可能在此过程中发现新的治疗靶点。
然而，越来越明显的是，基因在动态网络中运作，其中冗余、协同和拮抗基因协同产生强大的表型。识别网络任何基因功能的尝试可能会因其补偿和维持体内平衡的能力而受挫。因此，绘制基因网络的结构图仍然是一个相当大的挑战，这极大地限制了我们对临床相关过程（如恶性转化、耐药性发展和细胞可塑性）的理解。
为了克服这一挑战，纽约大学和纽约基因组中心的研究人员开发了 Cas13 RNA Perturb-seq （CaRPool-seq），这是一种新的 CRISPR 筛选方法，它利用单细胞测序和组合扰动策略（在每个细胞内同时操纵多个基因）。实际上，CaRPool-seq 允许研究人员开始解开基因网络及其支持的过程。
组合 CRISPR 筛选的挑战
为了识别网络中多个基因之间的相互作用，研究人员需要能够同时扰动其组成部分，包括单独和以各种组合。可以使用 Cas9 执行此操作，但是，这并不实用。gRNA 递送和编辑中常见的低效率意味着，平均而言，传统筛选中约 20% 的细胞将无法表达适当 gRNA 的可检测水平。这种低效率会进一步与需要递送的每个额外 gRNA 复合。因此，每个筛选中接收正确 gRNA 数量和组合的细胞数量可能非常低，并且极大地限制了组合筛选的规模。
已经开发了许多 Cas9 的替代品，包括 RfxCas13d（为简单起见，我们将其称为 Cas13d）。与 Cas9 一样，Cas13d 是一种 RNA 引导的核酸酶，可用于靶向特定基因。然而，Cas13d 具有几个独特的品质，使其特别适合组合筛选。
🧬 crRNA 阵列的合成
值得注意的是，构建长度接近 300 个核苷酸 （nt） 的 crRNA 阵列绝非易事。大多数寡核苷酸合成平台在这些较长的长度上会失去准确性（大多数在 150nt 或更短的长度下表现最佳）。在 CRISPR 筛选中，不准确可能非常成问题，因为它们会导致靶标结合效率低下和靶向错误，这两者都可能产生假阳性或假阴性结果。
Wessels 等人。从 Twist Bioscience 订购的 crRNA 阵列，其 DNA 合成平台具有独特的能力，能够生成长达 300nt 的寡核苷酸库，且具有很高的准确性（每 3000 个碱基仅产生 1 个错误）。
与 Cas9 不同，Cas13d 靶向单链 RNA。因此，它通常用于基因敲低，从而降低基因的表达，而不是基因敲除，后者完全消除基因。Cas13d 还使用一种更小的向导 RNA（称为 CRISPR RNA （crRNA） ）来靶向特定转录本。鉴于其较小的尺寸，可以通过单个载体将几种不同的 crRNA 递送到细胞中。一旦转录，这个串联的 crRNA 系列被称为阵列。Cas13d 能够处理该阵列并产生成熟的 crRNA，每个 crRNA 都可直接将核酸酶引导至不同的靶标。
因此，使用 crRNA 阵列和 Cas13d 使研究人员能够在细胞内递送并有效编辑多个基因，而不会出现困扰基于 Cas9 的方法的复合效率低下问题。换句话说，Cas13d 是组合筛选的理想选择。
使用 CaRPool-seq 进行高内涵组合 CRISPR 筛选
传统的 CRISPR 筛选方法依赖于简单的终点，例如细胞死亡或增殖，而最近的进展使得评估更复杂的表型读数成为可能。例如，Perturb-seq 利用单细胞 RNA 测序将基因扰动与其引发的转录组变化联系起来。这种详细的分析使研究人员能够更细致地了解基因的功能及其在更广泛的基因网络中的潜在作用。
执行这些分析的关键是能够识别每个细胞受到的扰动——在合并组合 CRISPR 筛选方面，这是一项艰巨的任务。
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在最近发表在《自然方法》上的一项研究中，Wessels 等人描述了一种新的筛选方法，该方法允许以混合格式和单细胞读数进行组合 CRISPR 筛选。这种方法被称为 CaRPool-seq，可将一系列串联 crRNA 递送到稳定表达 Cas13d 的细胞中。附加到该阵列末端的是 PCR 引物结合位点和独特的非靶向条形码序列。在数据收集过程中，PCR 扩增条形码的测序指示每个细胞接受的 crRNA 组合，从而可以进行单细胞分析的组合扰动。
CaRPool-seq 以其效率而著称。在一系列实验中，作者表明，无论阵列中的 crRNA 数量如何（0-3 个测试），近 70-80% 的筛选细胞都表达可检测的条形码。进行了基准测试分析，将 CaRPool-seq 性能与基于 Cas9 的方法进行比较。与 CaRPool-seq 相比，gRNA 的成功递送（即正确组合中的正确数量）仅发生在 49.6% 的细胞中，这可能反映了将 3 个 gRNA 递送到同一细胞的复合困难。
🤔 混合筛选与阵列筛选
CRISPR 筛选策略之间最高级别的划分之一涉及混合筛选与阵列筛选。
在混合筛选中，gRNA 文库被批量递送到靶细胞群中，因此研究中的每个细胞都可能携带与其相邻细胞不同的 gRNA。这种方法通常适用于大规模应用，其中 gRNA 的数量远远超过基于阵列的筛选的实际限制。然而，由于 sgRNA 在混合筛选中随机分散在整个群体中，因此研究人员需要设计一种方法将 gRNA 与观察到的表型联系起来。
另一方面，阵列筛选将 sgRNA 递送到特定的分离细胞群（通常分离到板上的不同孔中）。由于已知每个群体接受了哪些 sgRNA，因此无需测序技术将向导与其诱导的表型相关联。
虽然基于 Cas9 的方法（如 Perturb-seq）可用于组合筛选，但作者得出结论，通过 CaRPool-seq 获得的效率使其成为剖析基因网络的有吸引力的工具。作为证据，作者继续使用 CaRPool-seq 和 CITE-seq（转录组和表位的细胞索引）探索参与急性髓系白血病细胞恶性分化的基因网络。这种详细的筛选揭示了有助于分化过程的几个冗余和协同基因-基因关系。
效率在任何 CRISPR 筛选中都至关重要，尤其是那些规模大、复杂性高的筛选。Wessels 等人开发了一种高效的基因网络功能性 CRISPR 筛选方法。这种效率部分取决于 crRNA 阵列的准确合成。为此，该团队求助于 Twist Bioscience，该公司的 DNA 合成平台具有合成长寡核苷酸（长度可达 300nt）的独特能力。
原英文链接
使用 CaRPool-Seq 揭开基因网络的神秘面纱 |Twist 生物科学 (twistbioscience.com)
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