甲基化测序使用酶或化学方法将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。无论采取哪种方法，甲基化胞嘧啶在此过程中将保持完整。在扩增过程中， 各个尿嘧啶与互补链上的腺嘌呤配对，从而在未甲基化胞嘧啶的原始位置引入胸腺嘧啶。最终产物是不对称的，转化后形成两个不同的双链 DNA (dsDNA) 分子（图1上排）；对于甲基化的 DNA，同样的过程则生成了另外两个 dsDNA 分子（图1下排）。

图 1. 甲基化转化过程。未甲基化和甲基化 DNA 转化过程中的序列差异。

从以往的经验来看，甲基化测序文库的杂交捕获会导致脱靶捕获增加和捕获均一性降低。之所以会出现这些问题，是因为将未甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，会导致目标基因组的序列复杂度和 GC 含量降低（图 2）。

图 2. 转化对序列复杂度和 GC 含量的影响。与基因组的常规核苷酸组成相比，未甲基化胞嘧啶的转化导致序列复杂度显著降低。上面给出了一个随机基因组序列的例子，其中上图中的四种颜色分别代表四种核苷酸；下图中的两种颜色分别代表 G/C 或 A/T 含量。在富含 GC 的功能序列和甲基化靶区域中，转化后序列复杂度和 GC 含量 (%) 降低得更为明显，从而导致了诸多挑战，包括重复区域增加、脱靶捕获以及系统解链温度和动力学的普遍变化。

为了开发上述方法，Twist从数万个甲基化靶区域中采集数据，并用于确定转化后基因组的复杂度、重复度和背景如何影响组合性能。让用于过滤的几种常规指标得以达标。因此，Twist 获得了信息序列特征，用于开发新的优化，这些优化支持本技术说明中提出的性能改进。

虽然固态芯片仍广泛应用于甲基化检测中，但基于本说明中所述改进的高质量靶向富集组合探针类型，为在单碱基对分辨率下探索动态和细胞特异性甲基化靶区域提供了一种有吸引力的替代检测方式。

转化后基因组复杂度的变化意味着相对于标准的未转化序列，甲基化组合探针序列的过滤更具挑战性。甲基化检测文库的低复杂度、低 GC 含量、重复序列，迫使用户在包含测序困难靶区域与脱靶捕获增加、覆盖度下降和靶向区域变异识别可信度降低之间保持平衡。

通常，这意味着人们需要通过经验捕获数据，对组合探针进行迭代开发，进一步改进设计，但这将增加用户的成本。作为解决方案，我们开发了多种方法，可在定制甲基化组合探针设计期间实现三种不同级别的过滤严谨度，以获得高度优化的现成靶向富集方案。在订购过程中，用户可以根据自己的需求调整靶区域和过滤严谨度。

使用 1 Mb 和 1.5 Mb 的两个组合来测试具有低、中和高过滤严谨度的默认组合探针设计。结果表明，过滤严谨度提高了对脱靶率的控制，按照中等过滤严谨度去除 <1% 的探针，以及按照高过滤严谨度去除 3–5% 的探针后，可将脱靶率降低至 4%。重要的是，其他指标基本上不会受到设计严谨度变化的影响（图 3）。

图 3. 设计严谨度对测序性能的影响。提高设计严谨度可减少脱靶捕获。使用 1 Mb 和 1.5 Mb 的定制甲基化组合，遵照 Twist 靶向甲基化测序操作手册，对低、中、高严谨度的设计进行比较。采用以下建议的捕获条件：2 μl 甲基化促进剂、65°C 的清洗缓冲液 1 和 2 小时的杂交时间。在本说明中，结果通过以下方式获取：1) 使用 NextSeq® 500/550 High Output v2 试剂盒进行测序，以生成 2x76 双端测序片段，以及 2) 向下采样至相对于组合靶区域大小 200x 的覆盖度，使用 Bismark Aligner 进行比对，并使用 Picard HS 指标进行分析。

靶向富集系统通常包括阻断剂，以尽量减少捕获过程中的交叉杂交。在杂交反应中加入阻断剂限制了非特异性 DNA 相互作用，最终使得非靶向文库序列减少。虽然在标准靶向富集应用中有效地减少了脱靶捕获，但商用阻断剂并没有优化甲基化测序DNA文库的杂交捕获。Twist Bioscience创建了一款专有的阻断剂组合，称为甲基化促进剂，这款产品专为靶向甲基化测序而设计。该产品有效地抑制了酶或亚硫酸氢盐转化产生的重复脱靶文库序列的捕获。此外，该产品不会损害任何其他关键杂交选择指标。

Twist 甲基化促进剂可根据定制组合靶向区域和起始基因组 DNA 的甲基化状态，以可变方式减少脱靶捕获，而不会对杂交选择指标产生不利影响。在使用中等严谨度的 1.0 Mb 和 1.5 Mb 甲基化组合的单重反应中， 将 Twist 甲基化促进剂应用于 Twist 的靶向甲基化测序工作流程中。结果显示脱靶率降低了一半之多，低至 4%。其他关键捕获指标，包括均一性（fold-80 碱基罚分）、30x 覆盖度和重复率，基本上保持不变（图 4）。

图 4. Twist 甲基化促进剂对测序性能的影响。Twist 甲基化促进剂通过阻断非特异性脱靶捕获，有效地减少了脱靶捕获。使用 1.0 Mb 和 1.5 Mb 中等严谨度设计的定制甲基化组合和 200 ng 文库进行杂交捕获（NA12878，Coriell）。在所有反应中均采用了 Twist 建议的捕获条件，包括 2 μl Twist 甲基化促进剂、65°C 的清洗缓冲液 1 和 2 小时的杂交时间（参见图 3 了解其他方法）。

虽然传统的阻断剂并未针对甲基化进行优化调整，但它们对转化后序列仍然具有阻断活性。下面我们比较了 Twist 甲基化促进剂和标准阻断剂对于甲基化 DNA 的阻断能力。将两种阻断剂分别定量添加至单重杂交反应中，用一个未优化的 1.5 Mb 定制甲基化组合进行捕获，以比较它们的性能。定量添加每种阻断剂，以将等量的阻断剂添加至反应中进行比较。在这种情况下，Twist 甲基化促进剂将脱靶捕获减少了约 40%，而传统的标准阻断剂则将脱靶捕获减少了约 15%（图 5）。Twist Bioscience 建议用户首先在每个杂交反应中添加 2 µl Twist 甲基化促进剂，然后再根据每个特定定制甲基化组合的需要增加这一用量，最高可增加至 5 µl。

图 5. 定量添加 Twist 甲基化促进剂和标准阻断剂。如果使用量相近，相对于标准阻断剂，甲基化促进剂能更有效地减少脱靶。这些数据是使用两个阻断剂系统独立生成的。在每个反应中，两种阻断剂的使用量相同。使用 1.5 Mb 未优化的定制甲基化组合和 200 ng 文库进行杂交捕获（NA12878，Coriell）。参见图 3 了解其他方法。

低起始量样本的靶向甲基化测序通常存在相当大的挑战，因为未甲基化胞嘧啶的转化降低了基因组测序的复杂度。Twist 的甲基化检测系统通过组合探针的能力（可以实现不同级别的优化过滤严谨度）有效地克服了这些障碍，同时还引入了甲基化促进剂，这是一种定制的阻断剂，通过减少脱靶来产生协同作用，以提高系统性能。这两种优化都极大地提高了甲基化检测组合观测到的测序性能，促进了 Twist 甲基化检测系统可支持液体活检等高灵敏度应用的改进。

我们新近推出了Twist 甲基化 UMI 接头，能够有效减少重复测序读数的数量，并降低文库的重复率。我们将在之后的推文中为您进行详细介绍，敬请期待！

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