原英文链接：https://www.twistbioscience.com/cn/blog/science/cfDNA-library-preparation-kit

什么是ctDNA检测的关键？

良好的准备 Twist cfDNA文库制备试剂盒能够进行敏感的ctDNA研究 数字渲染的三个半透明的绿色DNA螺旋，背景为深蓝绿色

DNA的小片段可以讲述重要的故事，特别是当它们来源于癌细胞时。通过血液中游荡的DNA片段携带的突变可能暴露出一种新生的肿瘤，这种肿瘤正生长在常规检测极限之外。此外，在游离细胞DNA中发现的其他突变可以告诉人们一个正在发展治疗抗性的肿瘤。自然地，循环肿瘤DNA（ctDNA）及其所包含的信息已成为临床生物标志物的一个有前景的来源，其在早期癌症检测、治疗指导和最小残留病测试中的应用日益增多。

然而，ctDNA的难以捉摸的特性使其极难获取。用于液体活检的血液血浆、尿液和其他体液中充满了从全身健康组织释放的游离细胞DNA（cfDNA）。在这个遗传环境中，只有大约0.01%到10%的总cfDNA片段可能被识别为肿瘤来源。此外，并不总是清楚ctDNA会是什么样子：肿瘤相关的突变可能发生在数千个潜在的位点上。

液体活检的价值和潜力是一个持续研究的课题。因此，为了可靠地检测ctDNA，研究人员需要有能力限制测序范围到罕见的肿瘤衍生片段——以免他们将大量的测序资源浪费在无关的游离细胞DNA片段上——同时也要广泛撒网，以确保所有潜在的突变都被考虑到。幸运的是，下一代测序技术的最新进展有助于提高ctDNA检测的灵敏度和特异性，使文库制备和目标富集得到优化。Twist Bioscience有一个专门支持ctDNA研究的文库制备试剂盒（Twist cfDNA文库制备试剂盒）。

ctDNA的价值

循环中的肿瘤DNA片段越来越多地被视为有价值的临床信息来源，具有早期癌症筛查、最小残留病（MRD）测试、肿瘤分析和治疗决策的潜在应用。

“仅凭其存在，ctDNA就可以提供信息” 仅凭其存在，ctDNA就可以提供信息，表明可能存在恶性细胞。理论上，ctDNA可能从一个单一的癌细胞中释放出来，开启了在最早期阶段检测恶性生长的可能性。虽然开发如此敏感的测定方法仍面临重大挑战，但ctDNA的几种临床应用都是围绕这一原则建立的。例如，ctDNA已被证明是最小残留病测试的一个高度敏感的生物标志物。几项研究已经表明，ctDNA可以预测肿瘤复发，使得能够在传统手段检测到之前数月就检测到复发性肿瘤（在某些情况下，ctDNA识别了从未达到临床检测阈值的肿瘤）。这些测定的成功提出了使用ctDNA进行MRD和早期癌症筛查的常规使用的真正可能性。

同样重要的是ctDNA的缺失。经过治愈性治疗后，许多患者被主动给予辅助治疗以防止肿瘤复发。然而，这些疗法以其自己的方式也是严酷的，并可能造成伤害。已经发现，阴性MRD测试与肿瘤复发的可能性降低和对辅助治疗的需求减少有关。因此，一个真实的阴性可以用来避免患者受到不必要的伤害。

此外，ctDNA自然带来了关于其恶性起源的信息，以突变和表观遗传标记的形式。前者可以用来构建揭示肿瘤的治疗脆弱性（或缺乏）的突变概况。对于后者，甲基化模式可以用来确定ctDNA是从什么组织释放出来的。当检测转移性或新生肿瘤时，这些信息可能很有帮助。

为了进一步发展和完善这些潜在应用，需要进行大量研究，以及用于完成这些研究的工具的进步。

为影响做准备

ctDNA的稀有性对其检测构成了实质性挑战。可以使用高质量的目标捕获板有效地富集ctDNA片段样本，从而实现更深入（因此更有信心）的测序。然而，即使是最佳的目标富集工作流程也可能因文库制备不佳而失败。

文库制备是任何测序工作流程中的关键步骤，其中靶向遗传材料（在这种情况下是ctDNA）被制成适合下一代测序（NGS）。这涉及修复DNA片段上的单链悬突，将独特的分子标识符和NGS适配器连接至每端，以及随后的PCR扩增。在这个过程中，有几个机会出现错误，这些错误可能会大大降低测定的灵敏度和特异性。两个主要的错误来源是：

转换不良：不完全的末端修复和连接效率低下减少了正确转换为测序准备格式的片段数量。这是最显著的错误来源，可以大大减少测定灵敏度。失败的转换可能会消除存在的少数ctDNA片段，导致假阴性结果。 PCR错误：聚合酶每扩增十万个碱基对大约会犯两次错误。当这些错误在PCR过程早期发生时，错误的后续扩增可能使其看起来像是合法的，导致假阳性结果。

Twist开发了一个文库制备试剂盒（Twist cfDNA文库制备试剂盒），旨在最小化错误，最大化转换率，并实现自信的ctDNA分析。这是通过几个优化实现的，包括仔细调整的末端修复和适配器连接反应，使用高保真聚合酶，并使工作流程与双链测序兼容。

🧬 什么是双链测序？

双链测序是一种优雅的方法，用于最小化来自聚合酶和测序错误的假阳性。双链测序的主要目标是使用互补DNA序列的两个读段来验证发现。在生物信息学分析期间，利用原始源分子的两个互补链的读段来纠正任何假阳性错误。当两个互补链之间存在不一致时，可以推断发生了错误，观察到的突变是人为的。

与其他推荐用于细胞游离DNA（cfDNA）研究的NGS文库制备试剂盒相比（图1），Twist的方法提高了文库转化率（最终以文库产量衡量）和整体文库复杂度。在研究液体活检样本时，由于循环肿瘤DNA（ctDNA）片段的数量可能少于10个，因此高转化率对于检测灵敏度至关重要。

条形图显示了文库产量，其中Twist的文库产量超过120ng，而最接近的竞争对手仅略高于80ng。

图 1：Twist cfDNA文库制备试剂盒提供了更高的cfDNA转化率，从而获得更好的文库产量。文库生成后，用20μL水进行洗脱，然后用QubitTM dsDNA宽范围试剂盒对1μL样本进行定量。

当试图检测细胞游离DNA中的低频变异时，这一点尤为重要（图2）。无论是否使用二重测序，Twist cfDNA文库制备试剂盒的性能都远超竞争对手，显示出非常少的遗漏变异。

条形图显示了使用不同质量标准和不同制备试剂盒时遗漏的变异数量。在两个图中，Twist的cfDNA文库制备试剂盒显示出最低（<5）的遗漏变异数。 

图 2：Twist cfDNA文库制备和杂交捕获混合试剂盒能够在0.25% VAF的条件下灵敏、准确地检测变异。使用针对泛癌标准材料中217个SNP变异位点的定制50kb肿瘤检测组合对文库进行了单倍捕获。通过将小于1个变异家族的位点相加来计算遗漏的变异。

因此，Twist优化的文库制备工作流程（特别是与Twist杂交捕获板配合使用时）使研究人员能够克服一些阻碍ctDNA研究的关键挑战。通过这种方式，Twist正在为该领域解锁新的可能，使研究人员能够开发更灵敏的ctDNA检测方法，应用于日益扩大的领域。

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